Figlio di un conciatore di pelli, Pasteur si diplomò nel 1840 sia in lettere che in scienze al Collegio Reale di Besancon. Venne ammesso alla Scuola Normale Superiore di Parigi, dove nell'agosto del 1847 si laureò presentando due tesi, in chimica e in fisica, entrambe sviluppate nel campo della cristallografia.
Nel 1848 Pasteur venne assunto come professore di fisica al liceo di Digione, l'anno seguente divenne assistente alla Cattedra di chimica dell'Università di Strasburgo. Sempre nel 1849, nel mese di maggio, si sposò con Marie, figlia di Auguste Laurent, rettore dell'Università.
Nel 1854, nominato professore di chimica alla facoltà di scienze di Lilla, Pasteur iniziò a occuparsi di fermentazione, stimolato dalle richieste dei produttori di bevande alcoliche della regione. Gli scienziati dell'epoca ritenevano che la fermentazione alcolica fosse un fenomeno esclusivamente chimico, mentre Pasteur riuscì a dimostrare il ruolo essenziale svolto dai microrganismi in questo processo.
L'estensione di queste ricerche ai problemi di conservazione del latte lo portarono a ideare il processo, oggi conosciuto con il nome di pastorizzazione, che consente di uccidere i microrganismi dannosi eventualmente presenti nel latte, portando il liquido a 60-70° C per breve tempo prima dell'imbottigliamento.
La permanenza di Pasteur a Lilla si protrasse sino al 1857 quando venne chiamato alla Scuola Normale Superiore dove assunse l'incarico di amministratore e di vice-direttore degli studi scientifici. Venne in aiuto all'industria della seta del Sud della Francia, che si era trovata improvvisamente in gravi difficoltà a causa di un'epidemia che aveva colpito i bachi da seta, riuscendo a salvare la sericultura in Europa e dimostrando la natura contagiosa ed ereditaria della malattia. Gli studi sulla fermentazione e sulla generazione spontanea ebbero importanti ripercussioni in medicina, in quanto Pasteur intuì l'importanza del ruolo dei microrganismi nell'origine e nello sviluppo delle malattie. Si dedicò allo studio delle caratteristiche del carbonchio, una malattia del bestiame spesso fatale, e ne isolò il bacillo responsabile. Studiò i sistemi di prevenzione di numerose malattie: setticemia, colera difterite, tubercolosi, vaiolo e rabbia. Per la prevenzione della rabbia riuscì a sviluppare una forma attenuta del virus responsabile utilizzabile come vaccino che ha salvato migliaia di persone.
Il 14 novembre del 1888 fu fondato a Parigi l'Istituto Pasteur, oggi uno dei centri più importanti del mondo per la ricerca in biologia, in genetica molecolare e per gli studi sulle malattie infettive.
