Esperimenti

La microiniezione del DNA

Inserzione di DNA all'interno di oociti di topo per creare animali transgenici

L'inserzione del DNA negli oociti per produrre animali transgenici viene eseguita attraverso la tecnica della microiniezione.

microiniezione - operatore Al microscopio ottico l'operatore può eseguire questa tecnica grazie all'ausilio di uno strumento, il micromanipolatore. Si tratta di un complesso sistema che regola sia il movimento che la quantità di aria inspirata o espirata dalla pipetta e dal capillare che si utilizzano per microiniettare.

Infatti per la microiniezione l'oocita deve essere mantenuto fermo mediante una leggera suzione da un apposita pipetta, la holder, e il DNA viene fatto entrare grazie all'ausilio di un capillare di vetro dentro il quale è contenuto.

I movimenti che vengono eseguiti sono pertanto microscopici ed estremamente critici per l'integrità dell'oocita, pertanto è necessario questo strumento di precisione.

Le fasi della microiniezione:

Scelta dell'oocita da microiniettare La microiniezione si effettua al microscopio. Sulla destra della foto è visibile la holder, che verrà usata per mantenere fermo l'oocita. Sulla sinistra invece si può osservare il capillare contenente il DNA. In basso alcuni oociti.

Microiniezione Viene scelto l'oocita da iniettare e posizionato sulla holder mediante una leggera suzione.

Oocita con due pronuclei In alcuni casi possono essere direttamente visibili i due pronuclei, che si distinguono dal resto del contenuto del citoplasma per l'aspetto chiaro e per la frequente presenza di masserelle rotonde più scura all'interno: i nucleoli.

Ingresso del capillare nell'oocita Il capillare viene appoggiato sull'oocita e si esercita una lieve pressione, sufficiente a farlo deformare.

Ingresso del DNA nel pronucleo Quando la membrana cede il capillare viene fatto entrare fino all'interno del pronucleo maschile, che si riconosce perché di maggiori dimensioni.

A questo punto viene fatto entrare il DNA e si osserva un allargamento del pronucleo, corrispondente all'ingresso di materiale.

Estrazione del capillare dall'oocita L'operazione della microiniezione va eseguito molto rapidamente, per ridurre il tempo di stress dell'oocita, quindi non appena il DNA è stato inserito nel pronucleo il capillare viene estratto.

L' oocita dopo la microiniezione Il capillare dopo l'estrazione lascia l'oocita integro, in quanto l'elasticità e la composizione chimica della membrana sono tali per cui il foro provocato venga immediatamente richiuso.