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La datazione dell'epoca della morte (Post Mortem Interval, PMI) è il parametro principale che l'entomologo forense deve essere in grado di identificare. Per poterlo stimare si utilizzano fondamentalmente due approcci (Haskell et al., 1997; Erzinçlioglu, 1983):

a. lo studio della biocenosi presente sul cadavere: metodo utilizzato per studiare un PMI lungo e dove intervengono più ondate successive di insetti necrofagi;

b. la determinazione dello stadio di vita degli insetti che vengono rinvenuti sulla carcassa: metodo utilizzato per studiare un PMI breve e dove sono protagonisti i ditteri della prima ondata.

In entrambi i casi il luogo di ritrovamento del corpo e le temperature ambientali sono le informazioni di base per la corretta interpretazione dei dati entomologici. Tuttavia, l'analisi di questi ultimi non prescinde mai dall'esame medico legale sulla decomposizione cadaverica ed è semmai di supporto a questa: se la fase di decomposizione del corpo non corrisponde alle specie e alle fasi vitali degli insetti rinvenuti, l'investigatore dovrebbe sospettare che il processo è stato interrotto o modificato in qualche modo (Catts & Haskell, 1990).

L'analisi della biocenosi comprende l'identificazione delle specie alla luce dei fenomeni trasformativi post-mortem e delle caratteristiche ambientali. Per definire univocamente una specie si ricorre a metodi basati sulle «chiavi dicotomiche», cioè al confronto con connotazioni morfologiche, riportate e illustrate nei compendi entomologici, che permettono l'attribuzione di un dato esemplare a una specie ben caratterizzata. L'osservazione di tali strutture può essere eseguita con il microscopio ottico, lo stereoscopio ma anche con il microscopio elettronico a scansione (SEM). È oggi possibile utilizzare anche l'analisi del Dna per stabilire l'appartenenza di un insetto a una data specie.

Una volta caratterizzata la specie, si considerano i fenomeni trasformativi e l'ambiente circostante. I fenomeni trasformativi post-mortem nei diversi ambienti costituiscono una delle variabili più influenti nel calcolo del PMI. La putrefazione rappresenta il più importante processo naturale di distruzione post-mortale della materia organica. L'entomologo forense deve essere pienamente edotto circa l'insieme dei cambiamenti fisici e biochimici cui il corpo va incontro dopo la morte. Questi sono didatticamente suddivisi, dalla medicina legale, nelle seguenti fasi o "stadi di decomposizione":

- stadio fresco (fresh stage);

- stadio cromatico (cromatic stage);

- stadio enfisematoso o gassoso (bloated stage);

- stadio colliquativo (decay stage e advanced decay);

- stadio della scheletrizzazione (dry stage).

I fenomeni trasformativi determinano profonde modificazioni dell'aspetto e della struttura del cadavere, che sono caratteristiche per ognuna delle fasi appena elencate; essi non devono essere intesi come momenti rigidamente individuabili, quanto come una sequenza di fenomeni che si sovrappongono e si combinano tra loro in una progressione ininterrotta di eventi, fino alla distruzione della materia organica (Introna & Campobasso, 1998).

Ovviamente ogni stadio presenta una sua caratteristica popolazione entomologica, la quale, però, può essere non esclusiva di una data fase e comunemente associata alla presenza di altre specie. Anche in questo caso le condizioni ambientali giocano un ruolo fondamentale, influenzando contemporaneamente sia il naturale fenomeno putrefattivo, causato dall'azione enzimatica e dei microrganismi, sia l'azione della micro-fauna necrobionte. D'altra parte le specie d'insetti presenti sui resti organici dipendono fortemente dal particolare ambiente in cui è deposto il corpo e dalle modificazioni dello stesso. Quindi, se da una parte l'ambiente seleziona la fauna cadaverica, è altresì vero che quest'ultima modifica l'ambiente stesso di crescita.

Alla luce di quanto esposto si può affermare che l'enorme quantità di habitat esistenti e delle eventuali modificazioni rende praticamente impossibile una conoscenza analitica e sistematica di tutte le situazioni reali che si possono presentare; uno studio sugli ambienti più tipici può invece fornire importanti riferimenti di base.

a. Corpi in ambiente terrestre.

L'ambiente terrestre può causare profonde deviazioni dai valori riportati nelle "tabelle" in considerazione dei molti fattori che incidono sui fenomeni tanatologici. Tra i più importanti ricordiamo: clima e microclima, altitudine e latitudine, presenza e tipo di vegetazione, presenza di animali in grado di modificare l'habitat, presenza di acqua (dolce, salata o paludosa), natura del terreno (composizione chimica, permeabilità, compattezza, etc.), ambiente rurale o urbano, ambiente coltivato (i pesticidi determinano spesso un abbattimento differenziale dell'entomofauna, per cui molte specie che si trovano negli ambienti circostanti non si trovano più nelle coltivazioni);

b. Corpi in ambiente chiuso.

I luoghi più comuni sono le abitazioni con porte e finestre serrate, i bagagliai degli automezzi, i sacchi di plastica, etc.: più l'ambiente è "ermetico" più sarà difficile per gli insetti raggiungere il corpo e deporre le uova. Bisogna tenere presente che si tratta di animali piuttosto piccoli e basta una piccola fessura per permettere loro l'entrata. D'altra parte la ricerca di una via d'accesso al cadavere può portare ritardi che non sempre è possibile quantificare e che riducono il calcolo del PMI alla stima di un PMI minimo. Inoltre gli ambienti chiusi e/o quelli sottoposti a massiccia disinfestazione, al pari degli ambienti sottoposti all'uso intensivo di pesticidi, attuano una selezione dell'entomofauna. L'occultamento di un corpo in spazi inaccessibili o con sistemi di copertura a tenuta ermetica "cristallizzerà" l'entomofauna eventualmente presente al momento dell'occultamento del cadavere, avendo l'isolamento fisico impedito l'accesso di altre specie delle "ondate successive";

c. Corpi sepolti.

Il seppellimento, in dipendenza della profondità, rallenta il processo di decomposizione e ostacola o impedisce l'accesso agli invertebrati, modificando la normale successione delle specie. Solo un'entomofauna limitata raggiunge il corpo: questi insetti depongono le uova sulla superficie del terreno e le larve, attratte dal cadavere, lo raggiungono scavando nel terreno. Il processo di decadimento di un corpo sepolto, quindi, è simile a quello di un corpo esposto, cambia però il tipo di fauna; la presenza di insetti caratteristici della superficie, quindi, deve far supporre che la sepoltura sia avvenuta in un tempo successivo alla morte e alla colonizzazione da parte di esapodi tipici dell'habitat esterno. La possibilità d'accesso al corpo dipende anche dal tipo di terreno: ad esempio, in un terreno compatto e impermeabile come quello argilloso gli insetti possono accedere alla materia in decomposizione solo qualora la copertura di terra sia rimossa dagli animali o lavorata dall'uomo (Turner & Wiltshire, 1999). Più alto è lo strato di terreno sovrastante il cadavere, più lento sarà il processo di decomposizione e minore sarà il numero di insetti necrofagi che lo raggiungono (Turner, 1991). Studi condotti su cadaveri da Rodriguez e Bass (1985) hanno permesso di verificare che dopo un anno di sepoltura a una profondità di un metro è possibile trovare grandi quantità di tessuto ma non si trovano insetti. Il problema dei cadaveri sepolti è molto complesso e di non facile soluzione: esiste solo un unico studio sperimentale sulla biocenosi dei corpi interrati nel quale vengono considerate solo la velocità di decadimento dei cadaveri e le caratteristiche del suolo (Motter, 1898). Ancora oggi non esistono modelli esaurienti sulla relazione tra tipo di suolo e azione degli insetti sul corpo inumato.

d. Corpi in ambiente acquatico.

L'ambiente delle acque dolci e salate, in cui si trovano numerose larve di insetti, presenta una "nuova frontiera" per l'entomologia forense (Haskell et al., 1997; Magni e Scaravelli, 2006). Il corpo immerso in acqua dolce o salata subisce infatti un processo di decomposizione diverso rispetto a quello tipico dei cadaveri esposti all'aria, a causa dell'azione del liquido sul corpo e della diversa azione della fauna cadaverica che lo attacca. Gli insetti che abitano l'ecosistema acquatico non hanno abitudini alimentari esclusivamente necrofaghe, come capita per le specie terrestri; gli esapodi e i vertebrati acquatici vengono a contatto con il cadavere in qualità di opportunisti, predatori diretti/indiretti o semplicemente in modo casuale. Quando il corpo è completamente sommerso, la deposizione di uova da parte degli insetti della fauna terrestre è impossibile. Quindi il ritrovamento di uova di artropodi terrestri deve suggerire l'occultamento post-mortem per immersione. Cambiando prospettiva, è anche possibile ipotizzare che insetti caratteristici degli ambienti acquatici (fiumi, stagni e paludi) siano rinvenuti su un cadavere trovato molto distante da tali habitat; anche in questo caso si può immaginare che il corpo sia stato spostato dal luogo del evento criminoso.

Pure le alghe, i depositi di sedimenti e la presenza di macroinvertebrati acquatici (sia come animali integri sia come gusci, pupari e/o frammenti di entrambi) hanno dimostrato la loro utilità come mezzi di investigazione. Sebbene nel contesto acquatico esistano pochi indicatori entomologici con una precisione comparabile a quella degli insetti terrestri, sono comunque possibili osservazioni che aiutano nella stima del tempo d'immersione dopo la morte (PMSI, Post-Mortem Submersion Interval), come ad esempio le fasi di sviluppo d'animali e piante marine che usano il corpo come substrato di crescita.

I metodi utilizzati nell'analisi dello stadio di vita degli insetti generalmente comprendono un confronto tra i campioni prelevati sulla scena del crimine con campioni noti allevati in condizioni controllate (Kamal, 1958; Nortueva, 1977; Smith, 1986; Williams, 1984). È possibile stimare l'età del campione in esame riconoscendo alcune caratteristiche morfologiche e fisiologiche che distinguono gli stadi dello sviluppo dall'uovo all'adulto. In seguito, per ottenere una stima più precisa, si procede al sezionamento e all'esame microscopico dei tessuti dell'esemplare (in particolare la larva e in alcuni casi la pupa).

Alcuni parametri, come la sovrapposizione di strutture dello stadio "nascente" su quelle dello stadio precedente o il cambiamento di colore delle pupe, vengono attentamente considerati per stabilire lo stadio larvale e l'età del campione. Esistono diverse procedure attraverso cui è possibile definire l'età di una larva (Amendt et al., 2004):

- calcolo della lunghezza o del peso secco della larva e la comparazione di queste stime con dati di riferimento;

- studio delle strutture microscopiche;

- stima della storia termica dei ditteri o “somma termale”.

La lunghezza e il peso della larva sono parametri direttamente proporzionali, che crescono durante il periodo di feeding (nutrimento) e decrescono nel periodo post-feeding (Nishida, 1984; Davies & Ratcliffe, 1994); l'utilizzo di un «isomegalediagramma» e delle «scale di maturazione» proposte in letteratura risulta fondamentale per la corretta identificazione dello stadio dei campioni rinvenuti, poiché l'accorciamento delle larve, nel periodo post-feeding, può falsare la stima. Il calcolo del periodo di tempo necessario allo sviluppo dei diversi stadi larvali è possibile grazie a studi condotti in laboratorio su diverse specie di insetti necrofagi, in condizioni controllate (temperatura, luce e umidità) e direttamente sul campo in condizioni naturali selezionate (corpo esposto alla luce, in ombra, sotterrato, in acqua, bruciato, etc.). Queste sperimentazioni hanno permesso di stilare grafici che rappresentano un ottimo gradino di partenza per l'analisi dei nuovi casi, ma che non devono indurre l'entomologo forense ad una mera opera di applicazione dei valori in essi espressi. Ogni caso, infatti, è caratterizzato da variabili peculiari la cui disamina deve essere integrata con i dati oggettivi espressi dalle misurazioni in laboratorio. Le caratteristiche genetiche e l'adattamento ecologico delle singole specie possono influire sui ritmi di sviluppo, perciò può essere appropriato utilizzare i dati in letteratura che si riferiscono a sperimentazioni condotte nella stessa area zoogeografica (J. Amendt et al., 2006).

Lo studio delle strutture microscopiche delle larve, come l'apparato boccale e gli «spiracoli» posteriori, è effettuato attraverso sofisticati microscopi in grado di distinguere dettagli morfologici invisibili a occhio nudo. Il ritmo di crescita degli stadi immaturi dei ditteri dipende essenzialmente dalla temperatura ambientale, quindi è possibile risalire all'età dei campioni partendo dalla cosiddetta "storia termica" degli insetti, cioè effettuando la somma delle quantità di calore accumulate dagli esemplari durante la loro crescita.

Se lo specialista valutasse il PMI basandosi esclusivamente sulla temperatura media, riferita all'intera durata del ciclo di sviluppo larvale, rischierebbe tuttavia di dare un'erronea valutazione tanatocronologica. Oltre alle informazioni sulla temperatura ambientale è infatti fondamentale considerare eventuali motivi di elevazione termica, tra cui la densità della massa larvale, che influenza la "somma termale" ossia la quantità di calore assorbita dagli insetti. A causa dei movimenti frenetici degli insetti, ad esempio, la temperatura all'interno della massa larvale può essere significativamente più alta rispetto temperatura ambientale (Wells & LaMotte, 1995); la velocità di sviluppo delle larve è quindi alterata (ovvero accelerata) dall'energia cinetica dovuta all'azione demolitiva degli insetti. Sono riportati casi in cui all'interno della carcassa la temperatura raggiungeva picchi di 49°C, a fronte di una temperatura esterna che oscillava tra i 9 e i 22°C, ed esperienze in cui la massa larvale risultava attiva all'interno del substrato cadaverico, nonostante si registrasse una temperatura esterna di -4°C (C.C. Deonier, 1940). Il calore sviluppato dalla massa larvale ha quindi importanti risvolti medico-legali perché in alcune circostanze (ampia massa larvale estesa in più zone del corpo) è in grado di vanificare l'effetto refrigerante prodotto dalla cella frigorifera dove si trova il cadavere.

È da tenere presente che l'ovodeposizione non avviene fin quando non si instaura, complessivamente, quell'insieme di condizioni del substrato (ossia dei tessuti della carcassa) tale da favorire i primi stadi di sviluppo dell'uovo e/o della larva. Le femmine dei ditteri, ad esempio, non depongono su tessuti mummificati ma solo su quelli umidi perché solo in queste condizioni le larve possono svilupparsi.

Il cadavere, specialmente se esposto all'ambiente esterno, può essere considerato come un ecosistema a sé stante, soggetto a rapidi cambiamenti naturali dovuti alle diverse fasi della decomposizione (diminuzione della temperatura corporea, irrigidimento delle fibre muscolari, autolisi, acidità, etc.) e alla presenza della fauna necrobionte. Lo studio delle successioni (successional waves, «successioni di ondate» o «ondate di insetti») prende in considerazione tutti gli insetti contemporaneamente presenti su un cadavere, i rapporti che ciascuna specie contrae con le altre e il ruolo che i diversi organismi hanno nel modificare il substrato.

Le specie che possono essere raccolte differiscono in base alla regione in cui si lavora e alle diverse circostanze in cui è avvenuta la morte, ma in linea di massima l'andamento segue un decorso simile che è stato rappresentato da diversi autori con tabelle in cui sono descritte più "ondate" di colonizzazione in relazione alle fasi di decomposizione del cadavere (Smith, 1986; Turner, 1991). Attraverso questi studi, portati avanti grazie alle sperimentazioni su carcasse animali, in particolare suini, è stato possibile provare che in ogni stadio prevalgono numericamente alcune specie, anche se esemplari caratteristici degli altri stadi di decomposizione sono comunque presenti.

Le osservazioni sperimentali dimostrano che i diversi periodi di decomposizione e le particolari successioni di insetti non possono essere interpretati come una sequenza di fenomeni separati l'uno dall'altro, ma devono essere intesi come eventi che si sovrappongono e si combinano tra loro in una successione ininterrotta: questa sovrapposizione rappresenta la principale difficoltà nell'analisi ai fini medico-legali e richiede una provata esperienza da parte dell'operatore nell'interpretare i dati entomologici alla luce degli eventi ambientali.

Molte famiglie di insetti che appaiono presto sulla scena di morte possono comprendere specie non prettamente necrofaghe (Amendt J et al., 2004); queste specie possono determinare cambiamenti nella microfauna cadaverica attraverso fenomeni di predazione e parassitismo, la comprensione dei quali è indispensabile per non commettere errori interpretativi grossolani.